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今天我們較為詳細(xì)地聊一聊分離純化中常用的“硅膠柱層析”。

一、什么是硅膠柱層析？

硅膠柱層析，也叫硅膠柱色譜法，是一種利用混合物中各組分在固定相（硅膠）與流動(dòng)相（洗脫劑）之間的吸附能力差異，而達(dá)到分離目的的物理方法。

簡單打個(gè)比方：就如同“游泳比賽”，泳池賽道（色譜柱：填滿了硅膠的層析柱）；運(yùn)動(dòng)員（混合物樣品：各種不同結(jié)構(gòu)的化合物）；運(yùn)動(dòng)員的體能（流動(dòng)相：不斷向下流動(dòng)的洗脫劑）；水產(chǎn)生的阻力（固定相吸附力：硅膠對分子的吸附作用）。體能好、游泳技能高（即：吸附力弱的化合物與硅膠作用弱）游得快，先達(dá)終點(diǎn)；反之體能差、游泳技能一般（即：吸附力強(qiáng)的化合物與硅膠作用強(qiáng)）游得慢，后達(dá)終點(diǎn)。就這樣，不同的化合物就被分開。

二、硅膠柱層析核心原理

基于吸附色譜，即利用混合物中各組分在兩種不相混溶的相（固定相和流動(dòng)相）之間分配平衡的差異，從而實(shí)現(xiàn)分離。一般極性大的化合物與硅膠的吸附作用強(qiáng)，不容易被洗脫下來，在柱中移動(dòng)得慢；極性小的化合物與硅膠吸附作用弱，容易被溶劑洗脫下來，移動(dòng)得快。從而實(shí)現(xiàn)按極性從小到大依次被洗脫分離。

固定相：硅膠（SiO2·xH2O），它是一種多孔性物質(zhì)，表面含有大量的硅羥基（-Si-OH），這些基團(tuán)具有極性，能夠通過氫鍵、偶極-偶極相互作用、范德華力等吸附其他極性分子。

流動(dòng)相：有機(jī)溶劑（通常是非極性或極性不同的混合溶劑）。

一般極性小的用乙酸乙酯-石油醚體系，極性較大的用甲醇-二氯甲烷體系；具體也可以根據(jù)洗脫劑極性大小（以下面順序遞增）：正己烷<石油醚<環(huán)己烷<甲苯<二氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<甲醇<水<乙酸，進(jìn)行組合調(diào)整得到想要的極性流動(dòng)相。

三、硅膠柱層析具體操作過程

1.拌樣

一般拌樣硅膠選用60-80目硅膠，樣品與硅膠的比例控制在1:1~1:1.5，具體可以根據(jù)樣品的分離難度與樣品在溶劑中的溶解度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，確保樣品能完全吸附在硅膠上。

并不是所有樣品都需要拌樣，比如易揮發(fā)的揮發(fā)油，就可以直接上樣，不必拌樣。

2.制漿

根據(jù)待分離樣品的重量，稱取相應(yīng)比例重量的硅膠。一般用200-300目硅膠做填料，其用量是樣品的5~50倍，當(dāng)然也可以根據(jù)分離目的與難度調(diào)整填料的用量。選擇合適的容器，首先裝入硅膠體積約1倍量的裝柱溶劑，再緩慢加入硅膠，用棒沿著一個(gè)方向充分的攪拌，使其硅膠完全浸潤在洗脫劑中，同時(shí)排除漿液中空氣，并釋放出漿液中的熱量。如果樣品中待分離化合物用洗脫劑展板，其目標(biāo)斑點(diǎn)的Rf值是0.2，那么用裝柱洗脫劑展板，其目標(biāo)斑點(diǎn)的Rf值應(yīng)≤0.1。當(dāng)然也可以選擇洗脫劑中極性小的單一試劑做為裝柱溶劑。

舉例，如果洗脫劑是石油醚-乙酸乙酯-丙酮體系，就用石油醚做為裝柱溶劑，如果洗脫劑是二氯甲烷-醇體系，就用二氯甲烷做為裝柱溶劑。另外需根據(jù)樣品TLC展板的情況，控制勻漿中的含水量，如果TLC展開劑中不能有水，必須預(yù)先用無水硫酸鈉脫去洗脫劑中的水分，甚至還需對硅膠進(jìn)行預(yù)先干燥處理。

3.裝柱

一般采用濕法裝柱，以便得到更好的分離效果。

具體操作如下：

將制好的勻漿液，一次性或快速、連續(xù)地倒入下端含有液位高約1~5cm裝柱溶劑的色譜柱中。若柱層析管用的是無篩板玻璃柱，得用棉花將柱底塞緊（棉花一定不能塞的過厚，以免后期影響洗脫的流速）。注入勻漿后，同時(shí)打開柱下端活塞，讓裝柱溶劑流出，硅膠顆粒則在重力或壓力下均勻沉降。同時(shí)對層析管進(jìn)行敲打震動(dòng)，使其沉降均勻無氣泡。若為中壓色譜柱，則用泵將裝柱溶劑不斷的泵入柱內(nèi)（常用柱可以用加液球或氣壓泵加壓），直至下端流速恒定，一般柱內(nèi)填料約被壓縮至9/10的體積。該過程一定要確保柱內(nèi)的填料面不被擾動(dòng)，保持平整。

4.上樣

在填料界面上方預(yù)留一定高度的裝柱溶劑（液面高度一般取決于上樣量的多少與填料界面上方的剩余柱高，最佳液面高度為上完樣后預(yù)留液體液面高度約0.5cm），慢慢將干燥好的硅膠拌樣物加入柱內(nèi)。待上完樣后，在上樣層界面上方加入一層3-5cm高度的60-80目硅膠，再放入一層脫脂棉，用重物（干凈的玻璃瓶蓋、砂芯篩板等）壓實(shí)，再慢慢加入一些裝柱溶劑，使其完全浸入試劑中后，即可快速加入大量洗脫劑，而不會(huì)沖壞硅膠界面的平整。

5.洗脫與收集

柱層析要考慮分子擴(kuò)散效應(yīng)與分離度之間的權(quán)衡（及控制流速和洗脫劑的強(qiáng)度）。首先往柱子里加足量洗脫劑，液面高度保持10cm以上，若為常壓柱，可在柱頂蓋個(gè)小漏斗防止試劑揮發(fā)?？刂屏魉?，一般2-3BV/h（太快了組分分不開，太慢了耗時(shí)間），用下端活塞調(diào)節(jié)流速大小?？刂葡疵搫?qiáng)度，洗脫強(qiáng)度太低會(huì)導(dǎo)致洗脫效果不好（即目標(biāo)點(diǎn)用洗脫劑展開的Rf值過?。话銌我荒繕?biāo)點(diǎn)采用其Rf值約0.2的洗脫劑進(jìn)行洗脫，多個(gè)目標(biāo)點(diǎn)采用梯度洗脫。洗脫液收集一般用TLC分析判斷，每份收集量一般采用方式：雜質(zhì)斑點(diǎn)段用大瓶收集，快速通過；目標(biāo)斑點(diǎn)段（即目標(biāo)成分快出來時(shí)與目標(biāo)成分快結(jié)束時(shí)）換用小瓶密集收集，一般用試劑瓶，每瓶接200-500mL（根據(jù)柱子大小定），做好標(biāo)記，并根據(jù)TLC檢測分析純度。

四、注意事項(xiàng)與技巧總結(jié)

1.過柱前必須通過TLC摸索到合適的展開劑體系，并確認(rèn)分離效果，從而確定洗脫劑。

2.根據(jù)TLC確定的洗脫體系，是否全程控水很關(guān)鍵：若含水影響分離，那硅膠、樣品、溶劑都必須保持干燥，水分會(huì)嚴(yán)重破壞硅膠的吸附活性；反之若含水有利于分離，就不必過于控水。

3.確保選擇的柱層析洗脫劑對樣品具有較好的溶解性，避免樣品在洗脫過程中在柱內(nèi)析晶。

4.在未完全確定所有目標(biāo)物之前，不要輕易丟棄任何接收瓶中的液體，不要處理硅膠柱，以防產(chǎn)品損失。

5.根據(jù)分離的目的選擇硅膠規(guī)格與洗脫劑的極性：分離難度大、斑點(diǎn)接近選用細(xì)硅膠（200-300目），簡單分離可用較粗硅膠（60-80目）以加快流速。

6.用完的溶劑桶及時(shí)蓋好，存放在安全處。盡可能的控制柱層析過程中試劑揮發(fā)到操作環(huán)境，做到安全第一。

硅膠柱層析?適用分離中等極性至非極性的有機(jī)小分子化合物，如大多數(shù)天然產(chǎn)物、生物堿、黃酮類、苷類、有機(jī)酸、甾體、芳香族化合物等天然活性成分以及難以通過結(jié)晶分離的合成中間體。硅膠柱層析作為分離純化領(lǐng)域的經(jīng)典技術(shù)，其精妙原理及嚴(yán)謹(jǐn)操作，共同鑄就了高效精準(zhǔn)的分離效果。

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